62/2000 Chroń zdrowie niemowląt i małych dzieci! Chromatografia jonowa Wanyi określa siedem rodzajów ludzkiego mleka

Przedmowa

Oligosacharydy mleka ludzkiego (HMO) to grupa oligosacharydów o stopniu polimeryzacji nie większym niż 3, naturalnie występujących w mleku ludzkim;są trzecim co do wielkości składnikiem stałym w mleku ludzkimZastosowane są do regulacji flory jelitowej, zwłaszcza poprzez wspieranie kolonizacji bakterii bifidobacteriaceae w jelitach niemowląt, a jednocześnie utrzymywanie zdrowia jelit.wspieranie rozwoju układu odpornościowego i mózguOd czasu wprowadzenia do obrotu w Stanach Zjednoczonych w 2015 r. pierwszej formuły dla niemowląt wzbogaconej o HMO,szeroki wybór preparatów dla niemowląt, mleko i produkty mleczne, suplementy dla zdrowia trawiennego i żywność funkcjonalna zawierające HMO zostały sprzedane na całym świecie.2'-fucosyllaktoza, 3'-fucosyllaktozy, difucosyllaktozy, lakto-N-neotetrazy, lakto-N-tetrazy, 3'-sialyllaktozy i 6'-sialyllaktozy.

Wśród powszechnych metod wykrywania HMO, chromatografia ciekła wymaga reakcji pochodnej przed wykryciem, obejmuje złożone przygotowanie próbek, a odczynniki pochodne są często toksyczne;W przypadku HMO, które są nieprzewidywalne pod względem cieplnym, reakcja jest również niska i powtarzalność jest słaba w LC-MS.Natomiast chromatografia jonowa z detekcją amperometryczną węglowodanów zapewnia proste przygotowywanie próbek, wysoką odporność i dobrą powtarzalność, co daje jej wyraźne zalety w analizie HMO.Niniejsza notatka dotycząca zastosowania zawiera ręcznie przygotowany wodorotlenek sodu, octanu sodu i wody ultraczystej jako eluentów i wykorzystuje chromatograf jonowy WAYEAL IC6300 do określania HMO w formule dla niemowląt.wysoka wrażliwość i dobra liniowość, stanowiące przydatne odniesienie do wykrywania HMO w żywności.

Słowa kluczowe: chromatograf jonowy; oligosacharydy mleka ludzkiego; detektor amperometryczny.

1Instrumenty, sprzęt i czynniki czynne

1.1 Odczynniki i normy

Tabela 1. Wykaz czynników i norm

1.2 Materiały laboratoryjne i sprzęt pomocniczy

• 1.2.1 Waga analityczna (czytelność 0,1 mg);
• 1.2.2 kąpiel wodna termostatyczna;
• 1.2.3 Odśrodkowa;
• 1.2.4 Filtry membranowe z wodnych polietersulfonów (0,45 μm);
• 1.2.5 woda ultraczysta;
• 1.2.6 urządzenie do filtracji próżniowej;
• 1.2.7 wkłady wstępnej obróbki RP do ekstrakcji w fazie stałej (SPE);
• 1.2.8 Strzykawki jednorazowe (20 ml, 5 ml).

2Metoda eksperymentalna

2.1 Przygotowanie roztworu

• 2.1.1 Roztwór wodorotlenku sodu o pojemności 200 mmol/l: pipeta 10,5 ml z 50% NaOH, rozcieńczona wodą do 1000 ml i filtrowana pod próżnią.
• 2.1.2 Roztwór mieszany 75 mmol/l NaOH i 250 mmol/l octanu sodu: dokładnie waż 20,51 g octanu sodu, rozpuszczaj w wodzie i przenieś do kolby objętościowej o pojemności 1000 ml; dokładnie pipetę 3.95 ml 50% NaOH, rozcieńczyć do 1000 ml ultraczystą wodą i filtrować pod próżnią.
• 2.1.3 3% roztwór kwasu sulfosalicylowego: Zważyć 3,0 g kwasu sulfosalicylowego, rozpuścić w wodzie i rozcieńczyć do 100 ml (przygotuj świeżo).
• 2.1.4 Mieszany standardowy roztwór podstawowy: dokładnie waż 5 mg każdej z 2'-fukozyllaktosy, 3'-fukozyllaktosy, 3'-sialyllaktozy, 6'-sialyllaktozy, lakto-N-tetrozy i lakto-N-neotetrazy (z dokładnością do najbliższej 0.1 mg), umieszcza się w kolbie objętościowej o pojemności 10 ml, rozpuszcza się w wodzie i rozcieńcza się do oznaczenia w celu przygotowania mieszaniny 500 mg/l. Oddzielnie ważą się 1 mg difukozyllaktosy (z dokładnością 0,1 mg),umieszcza się w kolbie objętościowej 10 ml, rozpuszcza się i rozcieńcza do oznaczenia w celu przygotowania 100 mg/l.
• 2.1.5 Mieszane standardowe roztwory robocze: dokładnie pipetować mieszany roztwór podstawowy (2.1.4) do kolb objętościowych i rozcieńczyć wodą w celu przygotowania mieszanych roztworów roboczych 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT i DFL w temperaturze 0.5, 2, 4, 6, 8 i 10 mg/ l. Przygotować świeże przed użyciem.

2.2 Przygotowanie próbek

W małym kubku ważą się około 2,0 g próbki, dokładnie mieszają z 50 ml ciepłej wody (około 50 °C), dodaje się 40 ml 3% roztworu kwasu sulfosalicylowego,przeniesione i rozcieńczone do 100 ml w kolbie objętościowej, i sonikować przez 10 min. Filtruj przez papier filtracyjny lub wirówkę (12.000 obrotów/min, 15 min).wyrzucić pierwsze 3 ml i zebrać eluat do analizyPrzed użyciem, należy przygotować wkład RP SPE z 20 ml metanolu, a następnie 15 ml wody, i zrównoważyć przez 30 min.

2.3 Warunki eksperymentalne

2.3.1 Warunki chromatografii jonowej

3. Wyniki

3.1 Zakres liniowy

Analiza odpowiedniej alikwoty każdego mieszanego standardowego roztworu roboczego wynosiła 0,5-10 mg/l;odchylenia pomiędzy zmierzonymi i nominalnymi stężeniami były w granicach maksymalnie dopuszczalnego odchylenia, wartości R2 były powyżej 0.999, a wszystkie składniki wykazywały dobrą liniowość.

Tabela 2. Liniowe zakresy związków

Rysunek 1. Nakładane chromatogramy kalibracyjne siedmiu norm HMO

3.2 Wyniki badań próbek

Próbki 1 i 2 zostały poddane badaniom po dziesięciokrotnym rozcieńczeniu. Zawartość każdego z siedmiu HMO została obliczona w następujący sposób: X jest zawartością w próbce (mg/100 g);c jest stężeniem w roztworze próbki z krzywej kalibracyjnej (mg/l); V jest stałą objętością (mL); m jest masą próbki (g); f jest współczynnikiem rozcieńczania. Obliczone zawartości (mg/100 g) są następujące:

Rysunek 2. Chromatogram jonowy próbki 1 rozcieńczony 10 razy

Rysunek 3. Chromatogram jonowy próbki 2 rozcieńczony 10 razy

Tabela 3. Wyniki badań próbkowych

3.3 Dokładność

Roztwór roboczy na czwartym poziomie kalibracji analizowano podczas sześciu kolejnych wstrzyknięć w warunkach określonych w 2.3.1Wyniki poniżej wskazują na dobrą precyzję metody.

3.3.1 Standardowa precyzja powtarzalności

Wyniki badań:

Rysunek 4. Nakładane chromatogramy niezależnych wtrysków replikacji normy kalibracyjnej S4

Tabela 4. Dokładność powtarzalności normy

3.4 Granice wykrywania i ilościowania

LOD: alikwoty roztworu standardowego rozcieńczono do roztworu mieszanego zawierającego 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL i 160 μg/L 3'-SL;Przygotowano i przeanalizowano 20 równoległych próbek.

LOQ: Alikwoty roztworu standardowego rozcieńczono do roztworu mieszanego zawierającego 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL i 500 μg/L 3'-SL;Przygotowano i przeanalizowano sześć równoległych próbek.

Wyniki badań są następujące:

Tabela 5. Wyniki S/N dla LOD i LOQ siedmiu HMO

3.5 Specyfika

Do kolby objętościowej o pojemności 10 ml dodano alikwoty (100 μl każda) roztworów standardowych glukozy, fruktozy, sacharozy i maltozy i rozcieńczono do oznaczenia, rozcieńczono 67 razy roztwór próbki 2.Roztwór został poddany analizie w celu sprawdzenia, czy te cukry zakłócają szczyty siedmiu HMOJak pokazano poniżej, cztery cukry nie wykazywały istotnej interferencji z określeniem siedmiu HMO w mleku w proszku.

Rysunek 5. Nakładane chromatogramy kalibracji S6, próbki 2 i próbki 2 z czterema standardami cukru

4Wniosek

W tym zweryfikowaniu zastosowano chromatograf jonowy WAYEAL do weryfikacji metody określania HMO w żywności. Dane pokazują, że wszystkie szczyty chromatograficzne są dobrze ukształtowane bez ogona; 2'-FL, 3'-FL, DFL,LNnT, LNT, 6'-SL i 3'-SL wszystkie eluują w ciągu 60 min; wrażliwość spełnia wymagania krajowych norm, a współczynniki korelacji liniowej są większe niż 0.999. Powtarzalność zarówno standardów, jak i próbek jest dobra. Z wyjątkiem dwóch syalyllaktoz, LOD i LOQ są na poziomie μg/L. Metoda ma dobrą specyficzność, bez wykrywania zanieczyszczeń zakłócających,i ogólnie spełnia wymagania normy.