Oznaczanie aflatoksyny B₁, substancji rakotwórczej grupy 1, w uprawach oleistych za pomocą systemu Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

Aflatoksyna B₁jest wysoce toksycznym metabolitem wtórnym wytwarzanym głównie przez Aspergillus flavusi Aspergillus parasiticus. Spośród rodziny aflatoksyn wykazuje największą toksyczność i najszerszą dystrybucję. Wywiera swoje toksyczne działanie poprzez hamowanie wewnątrzkomórkowej syntezy DNA i RNA oraz zakłócanie metabolizmu białek, z wysoce ukierunkowanym szkodliwym działaniem na wątrobę.W porównaniu z innymi mikotoksynami, takimi jak ochratoksyna i patulina, aflatoksyna B₁jest wyjątkowo toksyczny i ma ugruntowaną rakotwórczość. Został sklasyfikowany jako Substancja rakotwórcza grupy 1przez Światową Organizację Zdrowia (WHO). Często wykrywa się go w uprawach oleistych, takich jak orzeszki ziemne, kukurydza, orzechy i oleje roślinne, co czyni go zanieczyszczeniem priorytetowym w kontroli bezpieczeństwa żywności na całym świecie.

Zanieczyszczenie aflatoksyną B₁zwykle występuje, gdy rośliny oleiste są narażone na działanie wysokiej temperatury i wysokiej wilgotności podczas sadzenia, zbioru lub przechowywania, co sprzyja rozwojowi grzybów. Ponadto, ze względu na swoje stabilne właściwości chemiczne, aflatoksyna B₁nie mogą zostać zniszczone przez konwencjonalne temperatury gotowania, co prowadzi do powtarzających się problemów z pozostałościami w produktach rolnych i przetworzonej żywności.

Krótkotrwałe spożycie dużej dawki może spowodować ostre zatrucie objawiające się takimi objawami jak silny ból brzucha, wymioty, żółtaczka i niewydolność wątroby, które w ciężkich przypadkach mogą zakończyć się śmiercią. Długotrwałe narażenie na małe dawki prowadzi do kumulacji w wątrobie, powodując przewlekłe uszkodzenie wątroby, takie jak zwłóknienie i marskość wątroby, a nawet może wywołać pierwotnego raka wątroby. Populacje o obniżonej odporności, w tym dzieci, osoby starsze i osoby z istniejącymi wcześniej chorobami wątroby, są bardziej narażone na aflatoksynę B₁zatrucie.

W Chinach norma krajowa GB 2761-2017 (Krajowa norma bezpieczeństwa żywności – maksymalne poziomy mykotoksyn w żywności) określa maksymalne limity pozostałości aflatoksyny B₁w różnych rodzajach żywności. Dodatkowo, GB 5009.22-2016 (Krajowa norma bezpieczeństwa żywności – Oznaczanie aflatoksyn B i G w żywności)podaje oficjalne metody analityczne oznaczania aflatoksyny B₁.

Niniejsza nota aplikacyjna opisuje ustanowienie metody chromatografii cieczowej z rozcieńczaniem izotopowym i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) do oznaczania aflatoksyny B₁przy użyciu systemu Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS.

Słowa kluczowe:Potrójny kwadrupol; Aflatoksyna B₁; Chromatografia cieczowa z rozcieńczaniem izotopowym – tandemowa spektrometria mas.

1. Urządzenie i odczynniki

1.1 Konfiguracja przyrządu

Tabela 1 Lista konfiguracji przyrządu

1.2 Odczynniki i standardy

Tabela 2 Odczynniki i standardy

1.3 Materiał eksperymentalny i sprzęt pomocniczy

Mikser wirowy

Wirówka wysokoobrotowa

Bilans analityczny

Odwirować

Kolektor do ekstrakcji fazy stałej (SPE) (z pompą próżniową)

Parownik azotu

Wibrator

2. Metoda eksperymentu

2.1 Przygotowanie roztworu

2.1.1 Roztwór octanu amonu o stężeniu 5 mmol/l:Odważyć 0,39 g octanu amonu, rozpuścić go w wodzie i rozcieńczyć do 1000 ml. Dobrze wymieszaj.

2.1.1 Roztwór metanol-acetonitryl:Dodać 100 ml acetonitrylu do 100 ml metanolu, następnie dobrze wymieszać.

2.2 Wstępna obróbka próbki

2.2.1 Ekstrakcja próbki

Przesiać mąkę pszenną przez sito probiercze o średnicy 2 mm. Odważ 5 g próbki (z dokładnością do 0,01 g) do 50 ml probówki wirówkowej. Dodaj 100μL roztworu roboczego wzorca wewnętrznego izotopu (100 ng/ml), wymieszać przez worteksowanie i odstawić na 30 min. Dodać 20 ml roztworu metanol-woda (70+30, v/v), wymieszać na worteksie i wytrząsać na wytrząsarce orbitalnej przez 20 minut. Wirować przy 6000 obr/min przez 10 min. Zbierz supernatant do późniejszego użycia.

2.2.2 Oczyszczanie próbki

Dokładnie przenieść 4 mL supernatantu do pojemnika, dodać 23 mL 1% Triton X-100 w PBS i dobrze wymieszać.

Po całkowitym opróżnieniu pierwotnej cieczy z kolumny powinowactwa immunologicznego przenieść powyższy roztwór próbki do cylindra strzykawki o pojemności 50 ml. Dostosuj natężenie przepływu tak, aby roztwór próbki przechodził przez kolumnę równomiernie z szybkością 1–3 mL/min. Po całkowitym opróżnieniu roztworu próbki dodać 2 × 10 mL wody do cylindra strzykawki i przemyć kolumnę immunopowinowactwa przy stałym natężeniu przepływu. Po odsączeniu wody wysuszyć kolumnę za pomocą pompy próżniowej.

Odłączyć system próżniowy. Umieścić probówkę z podziałką o pojemności 10 mL pod kolumną powinowactwa immunologicznego, wyjąć cylinder strzykawki o pojemności 50 mL i dodać 2 × 1 mL metanolu w celu elucji kolumny przy kontrolowanym natężeniu przepływu 1–3 mL/min. Następnie ponownie osuszyć kolumnę za pomocą pompy próżniowej. Zbierz cały eluat do probówki.Delikatnie odparować eluat prawie do sucha w strumieniu azotu w temperaturze 50°C. Dodać 1 ml początkowej fazy ruchomej, wirować przez 30 sekund w celu rozpuszczenia pozostałości. Przesączyć przez filtr membranowy o średnicy porów 0,22 µm i zebrać filtrat do fiolki autosamplera w celu późniejszego wstrzyknięcia.

2.3 Warunki eksperymentu

2.3.1 Metoda chromatografii cieczowej

Kolumna: C18, 1,7μm, 2,1×50 mm

Faza ruchoma Faza: A: Roztwór metanol-acetonitryl; Faza B: roztwór octanu amonu o stężeniu 5 mmol/l

Natężenie przepływu: 0,3 ml/min

Temperatura kolumny: 40°C

Objętość wtrysku: 3 µl

2.3.2 Metoda spektrometrii mas

Tabela 3 Parametry złożonej spektrometrii mas

Uwaga: gwiazdka (*) oznacza jon ilościowy.

3. Wynik eksperymentu

3.1 Standardowy chromatogram

Oznaczanie aflatoksyny B₁oraz wewnętrzny standard izotopowy 13C17-aflatoksyna B₁została ukończona w ciągu 5 minut. Jak pokazano na rysunku 1, oba anality wykazały doskonałe kształty pików i zadowalające reakcje, spełniając wymagania analizy eksperymentalnej.

Ryc. 1 Chromatogramy aflatoksyny B₁oraz wewnętrzny standard izotopowy 13C17​-Aflatoksyna B₁

3.2 Zakres liniowy

Odpowiednią objętość podstawowego roztworu wzorcowego i wewnętrznego roztworu roboczego wzorca mieszanych izotopów dokładnie przeniesiono i rozcieńczono początkową fazą ruchomą, aby przygotować serię standardowych roztworów roboczych z aflatoksyną B₁stężeniach 50, 20, 10, 5, 2, 1 i 0,5 ng/ml. Każdy roztwór zawierał wewnętrzny standard izotopowy w stężeniu 2 ng/ml. Przy użyciu tych standardów skonstruowano krzywą kalibracyjną. W zakresie liniowym 0,5–50 ng/ml i po korekcie za pomocą 13C 17-aflatoksyny B₁jako wzorzec wewnętrzny odchylenia pomiędzy zmierzoną i nominalną aflatoksyną B₁stężenia mieściły się w granicach maksymalnego dopuszczalnego odchylenia. Współczynnik korelacji (R) był większy niż 0,999, co wskazuje na doskonałą liniowość.

Ryc. 2 Krzywa standardowa aflatoksyny B₁

3.3 Powtarzalność

Roztwory wzorcowe w trzech stężeniach (1, 10 i 20 ng/ml) wstrzyknięto sześć razy z rzędu. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli. Względne odchylenia standardowe (RSD) czasów retencji i ilości próbek dla aflatoksyny B₁przy niskich, średnich i wysokich stężeniach wszystkie mieściły się w granicach 5%, spełniając wymagania eksperymentu.

Tabela 4 Test powtarzalności dla aflatoksyny B₁w niskich, średnich i wysokich stężeniach

3.4 Odzyskiwanie skoków

Aflatoksyna B₁Do próbki dodano roztwór standardowy, aby uzyskać końcowe stężenie 5 ng/ml. Wzbogaconą próbkę następnie analizowano metodą LC-MS/MS. Średni wynik z sześciu kolejnych wstrzyknięć wyniósł 5,147 ng/ml, przy RSD wynoszącym 1,954%. Obliczony stopień odzysku wyniósł 102,94%, co spełnia wymagania eksperymentu.

3.5 Pusta pozostałość

Po ciągłym wstrzykiwaniu roztworu wzorcowego o stężeniu 20 ng/ml, następnie wstrzyknięto ślepą próbkę w celu oceny pozostałości. Jak pokazano na Figurze 3, w ślepej próbce nie wykryto przeniesienia.

Ryc. 3 Ślepy chromatogram związku

3.6 Test próbki

Aflatoksyna B₁nie został wykryty w próbce A (ryc. 4).

Ryc. 4 Chromatogram aflatoksyny B₁w próbce A

4. Podsumowanie

W tym badaniu metoda chromatografii cieczowej z rozcieńczaniem izotopowym i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) do oznaczania aflatoksyny B₁ustalono przy użyciu układu chromatografii cieczowej Wayeal LCMS-TQ9200 z tandemową spektrometrią mas. Uzyskane dane pokazują, że wszystkie piki chromatograficzne wykazują dobre kształty pików bez ogonowania. Czułość spełnia wymagania eksperymentalne, a współczynnik korelacji (R) jest większy niż 0,999, spełniając kryteria liniowości. Powtarzalność przy niskich, średnich i wysokich stężeniach mieści się w granicach 5% i nie obserwuje się przeniesienia w systemie po wstrzyknięciu próbki o wysokim stężeniu. Wyniki te wskazują, że metoda wyposażona w układ chromatografii cieczowej Wayeal z tandemową spektrometrią mas spełnia wymagania rutynowej analizy jakościowej i ilościowej próbek docelowych.