Określenie pozostałości antybiotyków amfenikolu w mięsie kurczaka za pomocą Wayeal LCMS-TQ9200

Kluczowe słowa:LCMS, amfenikol, bezpieczeństwo żywności, pozostałości leków weterynaryjnych.

1Instrumenty i odczynniki

1.1 Wykaz konfiguracji LCMS

Tabela 1 Wykaz konfiguracji przyrządów

1.3 Materiały eksperymentalne i sprzęt pomocniczy

Czyszczyciel ultradźwiękowy

Mieszalnik wiru

Odparnik azotu do kąpieli wodnej

Centryfuga dużych prędkości

2Metody eksperymentalne

2.1 Przygotowanie roztworu

2.1.1 2% roztwór acetylu etylu amoniakowego: Weź 4 ml wody amoniakowej i rozcień ją do 200 ml acetatu etylu.

2.1.2 4% roztwór chlorku sodu: Weź 4 g chlorku sodu, rozpuść go w wodzie i rozcieńcz do 100 ml.

2.1.3 4% roztwór n-heksan nasycony chlorkiem sodu: Weź odpowiednią ilość 4% roztworu chlorku sodu, dodaj nadmiar n-heksanu, zmieszaj, pozwól odłożyć warstwę,i weź górną warstwę n-heksanu.

2.1.4 Mieszany wewnętrzny standardowy roztwór roboczy: należy wziąć odpowiednią ilość mieszanego wewnętrznego standardowego roztworu podstawowego,rozcieńczenie 20% metanolu w celu uzyskania chloramfenikolu-D5 w 10ng/ml i innych standardów wewnętrznych (florfenikolu-D3, tiamfenikolu-D3 i florfenikolu-aminy-D3) w dawce 50 ng/ml każda.

2.2 Przetwarzanie próbki

2.2.1 Ekstrakcja próbki: Zważenie 2 g próbki (z dokładnością ±0,01 g), dodanie 100 μl mieszanego wewnętrznego standardowego roztworu roboczego, wir przez 1 minutę, dodanie 10 ml 2% roztworu acetylu etylu amoniakowego,wir przez 10 minDodać do pozostałości kolejne 10 ml 2% roztworu acetylu etylowego amoniakowego i powtórzyć procedurę ekstrakcji.Połączyć dwa supernatanty, odparować do wyschnięcia pod strumieniem azotu w temperaturze 50°C i zachować do użycia.

2.2.2 Oczyszczanie próbki: do pozostałości oczyszczającej dodaje się 3 ml 4% roztworu chlorku sodu, wir do rozpuszczenia, następnie dodaje się 5 ml 4% roztworu n-heksan nasyconego chlorkiem sodu, wir na 30 sekund,odśrodkowanie przy 8000 obr./min przez 5 minDodać 5 ml 2% roztworu acetylu etylowego amoniakowego, wiruje przez 10 min, odśrodkowuje przy 8000 obrotów na minutę przez 5 min.i zebrać supernatantDodać do pozostałości kolejne 5 ml 2% roztworu acetylu etylowego amonowanego i powtórzyć procedurę ekstrakcji.dodaje się 1 ml 20% roztworu metanolu, wir 30s, filtrować przez membranę, i czekać na analizę instrumentalną.

2.3 Warunki eksperymentalne

2.3.1 Warunki chromatografii ciekłej

Kolumna chromatograficzna: C18 1,7μm 2,1x50mm

Faza ruchoma: A: acetonitryl; B: 2 mM formatu amonowego w wodzie

Przepływ: 0,3 ml/min

Temperatura kolumny: 40 °C

Objętość wstrzyknięcia: 5 μl

2.3.2 Warunki spektrometrii masowej

Tabela 3 Parametry źródła jonowego

3Wynik eksperymentu.

3.1 Standardowy chromatogram

Określenie czterech antybiotyków amidowych i ich standardów wewnętrznych zostało zakończone w ciągu 6 minut.i każde związek wykazał satysfakcjonującą odpowiedź, spełniające wymagania eksperymentalne.

Rys. 1 Chromatogram 4 Amfenikolu Antybiotyki i standard wewnętrzny (chloramfenikol 0,2 ng/ml, inne antybiotyki 1 ng/ml)

3.2 Zakres liniowy

Wziąć odpowiednią ilość roztworu standardowego mieszanego z amidowym alkoholem i stopniowo rozcieńczyć do szeregu stężeń w celu przygotowania krzywej standardowej.Do analizy ilościowej zastosowano wewnętrzną metodę standardową izotopówZakres liniowy wynosił 0,2-10 ng/ ml dla chloramfenikolu i 1- 50 ng/ ml dla florfenikolu aminu, tiamfenikolu i florfenikolu.Odchylenie pomiędzy wynikami wykrywania liniowego a znanymi stężeniami było mniejsze niż maksymalne dopuszczalne odchylenie, przy czym wartości R2 wahają się od 0,9958 do 0.9998, co wskazuje na doskonałą liniowość wszystkich elementów.

Tabela 4 Liniowy zakres związków

Rys. 2 Dane o krzywej kalibracyjnej czterech związków

3.3 LOD i LOQ

Chiński krajowy standard bezpieczeństwa żywności GB 31658.20-2022 określa, że w przypadku tej metody limit wykrywalności (LOD) dla chloramfenikolu wynosi 0,1 μg/kg, a limit ilościowy (LOQ) wynosi 0.2 μg/kg; natomiast dla tiamfenikolu, florfenikolu i aminy florfenikolu LOD wynosi 0,5 μg/kg, a LOQ 1 μg/kg.Stosunki sygnału do hałasu dla wszystkich związków docelowych w określonych stężeniach granicy wykrycia (LOD) i granicy ilościowej (LOQ) są znacznie większe niż 3 i 10, która spełnia wymagania dotyczące czułości określone w normie krajowej.

Tabela 5 Granice wykrywania i ilościowego określania dla każdego związku

Rys. 3 Chromatogramy limitów wykrywania i limitów ilościowych dla czterech związków

3.4 Badania precyzyjne

Wstrzyknąć amfenikol w niskich, średnich i wysokich stężeniach w roztworze standardowej mieszaniny i wykonać sześć kolejnych wstrzyknięć w celu porównania odchyleń w czasie retencji i obszarze szczytu.Wyniki przedstawiono w poniższej tabeliOdchylenia w czasie retencji wszystkich związków amfenikolu były mniejsze niż 1%, a odchylenia w obszarze szczytu były mniejsze niż 5%,spełniające wymóg precyzji RSD ≤ 15% określony w normie krajowej.

Tabela 6 Badanie precyzyjności dla każdego związku

Rys. 4 Precyzyjne chromatogramy czterech związków amidowych

3.5 Badanie odzyskiwania w wyniku przyrostów macierzystych

Dokładność tej metody wykrywania oceniono przy użyciu testu odzyskiwania pików.Przygotowanie próbek z matrycą na wysokimKażdy poziom stężenia w próbkach z dodatkiem został niezależnie analizowany sześć razy.Wskaźnik odzysku obliczono poprzez porównanie stężenia wykrytego w matrycy przed i po dodaniuWyniki pokazują się w następujący sposób: w matrycy kurczaków wskaźniki odzysku szczytowego wszystkich związków wahały się od 94,5% do 107,2%, przy CV w granicach 5%,wskazujące, że dokładność spełnia wymagania metody.

Tabela 6 Wskaźniki odzyskiwania związków w matrycy kurczaka

3.6 Badanie próbki

Przykładowo zakupione próbki piersi kurcząt w supermarketach zostały wyodrębnione i oczyszczone przy użyciu wspomnianej metody wstępnej obróbki próbek.nie wykryto żadnego z czterech antybiotyków amidowych.

Rys. 5 Chromatogram czterech związków amidowych w próbach piersi kurczaka w supermarkecie

4Wniosek

Metoda ta wykorzystuje układ spektrometrii masowej płynnej chromatografii Wayeal LCMS-TQ9200 do określania ilości antybiotyków amfenikolu w żywności pochodzenia zwierzęcego,umożliwiające jednoczesne pozyskiwanie związków zarówno w trybie pozytywnych, jak i ujemnych jonówDane wskazują na to, że metoda ta zapewnia dobrze ukształtowane szczyty chromatograficzne bez odlewu, a jej czułość spełnia wymagania krajowych norm.Wszystkie współczynniki korelacji liniowej są większe niż 0..99Odchylenie czasu retencji dla wszystkich związków w ciągu sześciu kolejnych wstrzyknięć wynosi nie więcej niż 1%, a odchylenie obszaru szczytowego wynosi nie więcej niż 5%, co pokazuje dobrą precyzję.Wskaźniki odzyskiwania w matrycy kurczaka wahają się od 94Wyniki analizowano próbki piersi kurcząt zakupione losowo w supermarketach,i żaden z czterech antybiotyków amfenikolu nie został wykrytyWykazuje to, że metoda, wyposażona w system płynnej chromatografii-spektrometrii masowej Wayeal,spełnia wymogi rutynowego wykrywania jakościowego i ilościowego prób docelowych.