Oznaczanie pozostałości erytromycyny w pozostałościach po fermentacji antybiotyków za pomocą systemu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas Wayeal LCMS-TQ9200

Erytromycyna jest antybiotykiem makrolidowym wytwarzanym w wyniku fermentacji Streptomyces erythreus. Działa przeciwbakteryjnie, przede wszystkim hamując syntezę białek bakteryjnych. Produkcja erytromycyny opiera się głównie na technologii biofermentacji, obejmującej takie etapy jak selekcja szczepu, hodowla zarodkowa, fermentacja na dużą skalę w zbiornikach, ekstrakcja i oczyszczanie. Po fermentacji erytromycyna jest ekstrahowana rozpuszczalnikami organicznymi (takimi jak octan butylu), a następnie oczyszczana przez krystalizację lub separację za pomocą żywicy jonowymiennej, co ostatecznie daje sole klasy klinicznej (np. etylosukcynian erytromycyny). Jednak proces produkcji erytromycyny generuje znaczną ilość osadów po fermentacji (resztki fermentacyjne), które mogą zawierać pozostałości antybiotyków, białka drobnoustrojów i produkty uboczne metabolizmu. Jeśli nie są one odpowiednio zarządzane, te pozostałości mogą przedostać się do łańcucha ekologicznego poprzez zrzuty do środowiska lub wykorzystanie jako dodatki paszowe, prowadząc do wielu zagrożeń: Pozostałości erytromycyny mogą sprzyjać rozprzestrzenianiu się genów oporności na antybiotyki w glebie i zbiornikach wodnych, zakłócając równowagę społeczności drobnoustrojów; wzmocnione przez łańcuch pokarmowy, mogą indukować pojawienie się opornych szczepów bakteryjnych u zwierząt lub ludzi, osłabiając skuteczność antybiotyków; ponadto niewykorzystana materia organiczna w pozostałościach może powodować zanieczyszczenie środowiska. Dlatego ścisła regulacja pozostałości po fermentacji jest krytycznym środkiem kontroli zanieczyszczeń pochodzących z produkcji erytromycyny.

Eksperyment ten przeprowadzono w odniesieniu do standardu „T/PIAC 00003—2021 Standard Grupowy Chińskiego Stowarzyszenia Przemysłu Farmaceutycznego - Metoda oznaczania erytromycyny w pozostałościach antybiotyków, materiałach bazowych nawozów organicznych, uprawach i mediach środowiskowych”, wykorzystując system chromatografii cieczowej-spektrometrii mas Wayeal LCMS-TQ9200 do określenia zawartości erytromycyny w osadach po fermentacji. Wyniki eksperymentu wskazują, że test przydatności systemu wykazał dobry kształt piku i dobrą liniowość, spełniając wymagania eksperymentalne.

1. Instrumenty i odczynniki

1.1 Lista konfiguracji LCMS

Tabela 1 Lista konfiguracji instrumentów

1.2 Odczynniki i standardy

Tabela 2 Lista odczynników i standardów

1.3 Materiał eksperymentalny i sprzęt pomocniczy

Myjka ultradźwiękowa

Mieszadło wirowe

Wysokowydajna wirówka

2. Metoda eksperymentu

2.1 Wstępne przygotowanie próbki

Odważyć 0,5 g próbki (z dokładnością do 0,001 g) do probówki ze szklanym korkiem. Dodać 50 ml acetonitrylu, wymieszać w wirówce przez 1 minutę w celu ujednolicenia mieszaniny i przeprowadzić ekstrakcję wspomaganą ultradźwiękami przez 20 minut. Następnie przenieść mieszaninę do 50 ml probówki wirówkowej i odwirować przy 4000 obr./min przez 10 minut. Zebrać odpowiednią ilość supernatantu i przepuścić go przez membranę filtracyjną 0,22μm. Odrzucić co najmniej 1 ml początkowego przesączu, a następnie przenieść pozostały przesącz do fiolki LC bursztynowej do analizy.

2.2 Warunki eksperymentu

2.2.1 Warunki metody chromatografii cieczowej

Kolumna chromatograficzna: C18 1,7μm 2,1x50mm

Faza ruchoma: A: Acetonitryl, B: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie

Szybkość przepływu: 0,3 ml/min

Temperatura kolumny: 30℃

Objętość wtrysku: 2μL

2.2.2 Warunki metody spektrometru mas

Tabela 3 Parametry źródła jonów spektrometrii mas

3. Wynik eksperymentu

3.1 Test przydatności systemu

Wyniki testu przydatności systemu wykazały dobrze zdefiniowane piki docelowe bez zakłóceń ze strony pików obcych, spełniając wszystkie wymagania eksperymentalne.

Rys. 1 Chromatogram roztworu roboczego standardu erytromycyny A (0,5 ng/ml)

3.2 Zakres liniowy

Krzywą kalibracji dla erytromycyny A przygotowano przez szeregowe rozcieńczanie roztworu standardowego za pomocą roztworów roboczych o pośrednim stężeniu. Krzywa wykazała doskonałą liniowość w zakresie 0,5-500 ng/ml, ze współczynnikiem korelacji (R²) większym niż 0,99.

Tabela 4 Zakres liniowy erytromycyny A

Rys. 2 Krzywa kalibracji dla erytromycyny A

3.3 Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ)

W tej metodzie granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) dla roztworu standardowego erytromycyny A określono odpowiednio na 0,2 ng/ml i 0,5 ng/ml. Odpowiednie stosunki sygnału do szumu (S/N) wynosiły 110,02 i 292,20, znacznie przekraczając minimalne wymagania 3 i 10, tym samym spełniając kryteria czułości eksperymentalnej.

Rysunek 3. Wyekstrahowane chromatogramy jonowe dla LOD i LOQ erytromycyny A

3.4 Test precyzji

Roztwór erytromycyny A wstrzyknięto kolejno siedem razy, a wyniki przedstawiono na poniższym rysunku. Odchylenie czasu retencji dla erytromycyny A wyniosło 0,19%, a odchylenie powierzchni piku wyniosło 0,96%, oba poniżej 5%, spełniając wymagania eksperymentalne.

Rysunek 4. Chromatogramy precyzji próbki erytromycyny A (7 wstrzyknięć)

3.5 Test próbki

Zgodnie z wyżej wymienioną metodą wstępnego przygotowania, pole powierzchni piku docelowego w próbce stałej wyniosło 7,4E6. Obliczona metodą standardu zewnętrznego, zawartość erytromycyny A w roztworze próbki została określona na 400 ng/ml.

Rys. 5 Chromatogram testu próbki erytromycyny A

4. Wniosek

Metoda ta wykorzystuje system chromatografii cieczowej-spektrometrii mas Wayeal LCMS-TQ9200 do oznaczania zawartości erytromycyny A w pozostałościach po fermentacji antybiotyków. Dane wskazują, że metoda wykazuje doskonałą wydajność: wszystkie piki chromatograficzne wykazują optymalny kształt bez ogonowania, a czułość spełnia wymagania eksperymentalne. Współczynnik korelacji liniowej (R²) przekracza 0,99. Odchylenia czasu retencji i powierzchni piku dla wszystkich związków w siedmiu kolejnych wstrzyknięciach mieszczą się w granicach 1%, co wskazuje na wysoką precyzję. Chromatogramy próbek nie wykazują zakłóceń ze strony pików obcych, a zmierzona zawartość próbki wynosi 400 ng/ml. Metoda ta, wyposażona w system Wayeal LC-MS/MS, spełnia wymagania dotyczące rutynowej analizy jakościowej i ilościowej próbek testowych.