Określenie rodaminy B w proszku chili za pomocą systemu WAYEAL LCMS-TQ9200 LCMS/MS

Rhodamina B (zwana również Czerwień Róży B lub Fiolet Zasadowy 10) to syntetyczny, zasadowy barwnik fluorescencyjny należący do klasy związków ksantenowych. Substancja ta sama w sobie ma jaskrawy, różowo-czerwony kolor i jest łatwo rozpuszczalna w rozpuszczalnikach polarnych, takich jak woda i etanol. Początkowo była szeroko stosowana w przemyśle, w tym w przędzalnictwie, drukarstwie i znakowaniu fluorescencyjnym. Ze względu na niski koszt i silne właściwości barwiące, niektórzy nieuczciwi sprzedawcy nielegalnie dodawali ją do produktów spożywczych w celach barwiących, takich jak proszek chili, pieprz syczuański, produkty mięsne i przyprawy, co czyni ją ważnym zanieczyszczeniem zagrażającym bezpieczeństwu żywności.
Rhodamina B jest wyraźnie toksyczna dla organizmu ludzkiego. Może dostać się do organizmu przez przewód pokarmowy lub skórę, zakłócając normalny metabolizm fizjologiczny. Ponadto stwarza potencjalne ryzyko kancerogenne i mutagenne. W związku z tym została sklasyfikowana jako substancja niejadalna, zakazana w żywności przez wiele krajów. Jest kluczowym celem nadzoru nad bezpieczeństwem żywności, a jej wskaźnik wykrywalności pozostaje stale wysoki w różnych przyprawach i przetworzonej żywności.

W niniejszej nocie aplikacyjnej opracowano metodę chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) do oznaczania rodaminy B w żywności przy użyciu systemu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas WAYEAL LCMS-TQ9200. Metoda ta zapewnia wydajną ekstrakcję, precyzyjną separację i czułą kwantyfikację analitu docelowego, jednocześnie skutecznie eliminując zakłócenia matrycy żywności. Oferuje niezawodne wsparcie techniczne dla szybkiego przesiewu i dokładnej kwantyfikacji rodaminy B w żywności, ułatwiając tym samym skuteczny nadzór nad bezpieczeństwem żywności.

Słowa kluczowe: Bezpieczeństwo żywności, Rodamina B, LCMS/MS

1. Aparatura i odczynniki

1.1 Konfiguracja aparatury

Tabela 1 Lista konfiguracji aparatury

1.2 Lista odczynników i wzorców

Tabela 2 Lista odczynników i wzorców

1.3 Materiał eksperymentalny i sprzęt pomocniczy

Mieszadło vortex

Wirówka wysokoobrotowa

Waga analityczna

Manifold do ekstrakcji fazy stałej (z pompą próżniową)

Parownica azotowa

Mieszadło orbitalne

2. Metoda eksperymentalna

2.1 Przygotowanie roztworów

2.1.1 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie: Przenieść 1 ml kwasu mrówkowego do 500 ml wody, dokładnie wymieszać i uzupełnić do objętości 1000 ml wodą.

2.1.2 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu: Przenieść 1 ml kwasu mrówkowego do 500 ml acetonitrylu, dokładnie wymieszać i uzupełnić do objętości 1000 ml acetonitrylem.

2.1.3 50% metanolu w wodzie: Dokładnie przenieść 500 ml metanolu do kolby miarowej o pojemności 1 L, a następnie uzupełnić wodą do objętości.

2.1.4 50% metanolu w wodzie z 0,1% kwasu mrówkowego: Przenieść 1 ml kwasu mrówkowego do 500 ml 50% metanolu w wodzie, dokładnie wymieszać i rozcieńczyć do objętości 1000 ml 50% metanolem w wodzie.

2.1.5 5% amoniaku w metanolu: Przenieść 5 ml roztworu amoniaku do kolby miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić metanolem do objętości i dokładnie wymieszać.

2.2 Przedobróbka próbki

2.2.1 Ekstrakcja próbki

Dokładnie odważyć 1 g próbki proszku chili do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dokładnie dodać 10,0 ml 50% wodnego roztworu metanolu zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego i dobrze wymieszać. Dodać dwa ceramiczne homogenizatory, a następnie wirować przez 15 minut na mieszadle vortex. Wirować przy 8000 obr./min przez 10 minut. Przenieść 3 ml nadczystego (warstwa ekstraktu) i przefiltrować przez membranę filtracyjną fazy organicznej 0,45 μm przed oczyszczaniem.

2.2.2 Oczyszczanie próbki

Kondycjonowanie wkładu do ekstrakcji fazy stałej (SPE) NovaPre MCX: Przed użyciem aktywować wkład sekwencyjnie 3 ml metanolu i 3 ml wody.

Dokładnie przenieść 1,0 ml ekstraktu na wkład do ekstrakcji fazy stałej (SPE) NovaPre MCX. Sekwencyjnie przemyć wkład 3 ml 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie, 3 ml wody i 3 ml metanolu. Eluować analit docelowy 6 ml roztworu amoniaku w metanolu i zebrać eluat. Odparować eluat do prawie suchości pod strumieniem azotu w temperaturze 45°C. Rozpuścić pozostałość w 0,5 ml początkowej fazy ruchomej, przefiltrować przez membranę filtracyjną fazy organicznej 0,22 μm, a następnie wstrzyknąć filtrat do analizy instrumentalnej.

2.3 Warunki eksperymentalne

2.3.1 Warunki HPLC

Kolumna chromatograficzna: C18, 1,7 μm, 2,1*50 mm;
Faza ruchoma: Faza A: 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie; Faza B: 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu;
Szybkość przepływu: 0,4 ml/min;
Temperatura kolumny: 40 °C;
Objętość wstrzyknięcia: 1 μl.

2.3.2 Warunki spektrometrii mas

Tabela 3 Parametry spektrometrii mas związków

Uwaga: * jon kwantyfikujący.

3. Wyniki eksperymentalne

3.1 Chromatogram wzorców

Detekcja rodaminy B została zakończona w ciągu 7 minut. Jak pokazano na Rysunku 1, pik związku wykazywał dobre kształtowanie piku i zadowalającą odpowiedź, spełniając wymagania dotyczące oznaczenia eksperymentalnego.

Rys. 1 Chromatogram rodaminy B

3.2 Zakres liniowy

Odpowiednią ilość roboczego roztworu wzorca rodaminy B dokładnie przeniesiono i rozcieńczono początkową fazą ruchomą w celu przygotowania krzywej kalibracyjnej. Zakres liniowy wynosił 0,1–10 ng/ml. Odchylenie między wynikami liniowymi a znanymi stężeniami mieściło się w maksymalnym dopuszczalnym odchyleniu. Współczynnik determinacji (R²) był większy niż 0,999, co wskazuje na dobrą liniowość.

Rys. 2 Krzywa kalibracyjna rodaminy B

3.3 Granica kwantyfikacji i granica detekcji

W tej metodzie granica detekcji (LOD) i granica kwantyfikacji (LOQ) dla rodaminy B zostały ustalone odpowiednio na 0,1 ng/ml i 0,5 ng/ml. Odpowiadające im stosunki sygnału do szumu (S/N) podsumowano w poniższej tabeli. Stosunki S/N przy LOD przekroczyły 3, podczas gdy przy LOQ przekroczyły 10.

Tabela 4 Granica kwantyfikacji i granica detekcji

Rys. 3 Stosunek sygnału do szumu przy LOD dla rodaminy B (0,1 ng/ml)

Rys. 4 Stosunek sygnału do szumu przy LOQ dla rodaminy B (0,5 ng/ml)

3.4 Powtarzalność

Roztwory wzorcowe o trzech stężeniach (0,5, 2 i 5 ng/ml) wstrzykiwano sześciokrotnie kolejno. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli. Względne odchylenia standardowe (RSD) czasu retencji i powierzchni piku dla rodaminy B przy niskich, średnich i wysokich stężeniach mieściły się w granicach 5%, spełniając wymagania eksperymentalne.

Tabela 5. Test powtarzalności dla rodaminy B przy niskich, średnich i wysokich stężeniach

Rys. 5 Chromatogramy 6 kolejnych wstrzyknięć 0,5 ng/ml rodaminy B

Rys. 6 Chromatogramy 6 kolejnych wstrzyknięć 2 ng/ml rodaminy B

Rys. 7 Chromatogramy 6 kolejnych wstrzyknięć 5 ng/ml rodaminy B

3.5 Odzysk po dodaniu wzorca

Próbkę A wzbogacono roztworem wzorca, aby zwiększyć stężenie rodaminy B o 2 ng/ml. Następnie analizowano sześć powtórzeń wstrzyknięć. Uzyskany odzysk wyniósł 105,7% przy RSD 1,473%, co spełnia kryteria akceptacji metody.

3.6 Zanieczyszczenie krzyżowe

Po wstrzyknięciu roztworu wzorca 10 ng/ml wstrzyknięto pusty rozpuszczalnik w celu oceny zanieczyszczenia krzyżowego. Wyniki przedstawiono na poniższym rysunku. Zanieczyszczenie krzyżowe w pustym roztworze było mniejsze niż 10% najniższego wzorca kalibracyjnego (0,1 ng/ml), co spełnia wymagania eksperymentalne.

Rys. 8 Chromatogram pustego roztworu związku

3.7 Test próbki

Stężenie rodaminy B w próbce A było poniżej metodycznej granicy detekcji (MDL).

Rys. 9 Chromatogram rodaminy B w próbce A

4. Wnioski

W niniejszym badaniu opracowano metodę chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) do oznaczania rodaminy B przy użyciu systemu WAYEAL LCMS-TQ9200. Uzyskane dane wykazały, że metoda generuje piki chromatograficzne o dobrej symetrii i bez ogonowania, a czułość spełnia wymagania eksperymentalne. Współczynnik determinacji (R²) był większy niż 0,999, spełniając kryteria liniowości. Powtarzalność (RSD) przy niskich, średnich i wysokich stężeniach mieściła się w granicach 5%, a zanieczyszczenie krzyżowe w pustym roztworze było mniejsze niż 10% najniższego wzorca kalibracyjnego. Wyniki te wskazują, że metoda, w połączeniu z systemem WAYEAL LC-MS/MS, jest w stanie sprostać rutynowym wymaganiom jakościowym i ilościowym w zakresie wykrywania analitów docelowych.