2025-10-16
Detektor rozpraszania światła przez odparowanie (ELSD) jest nowym detektorem masy, który teoretycznie może być stosowany do każdego związku, który może tworzyć cząstki gazowe.W wydaniu farmakopei z 2025 r. określono stosowanie metod wykrywania rozpraszania światła przez odparowanie (ELSD) do analizy i kontroli jakości ponad 100 odmian leków.W praktyce ELSD stosuje się częściej do związków niezdolnych do wchłaniania promieni ultrafioletowych (UV), takich jak astragalozyd, węglowodany, aminoglikozydy i cholesterol,często służą jako uzupełniająca metoda wykrywania detektorów UV i fluorescencyjnychWyniki ELSD są jednak pod wpływem wielu czynników, w tym składu fazy ruchomej, stężenia rozpuszczalnika organicznego, trybu elucji i warunków nebulizacji.w celu zapewnienia dokładnych i spójnych wyników analitycznych, konieczne jest ocena wpływu tych czynników na wyniki.
Badanie to, w którym odwołano się do metody analitycznej dla chlorku wodorowego spektinomycyny z części II Farmakopei 2025 i kierowane zasadami ICH QbD,zastosowano ortogonalny projekt eksperymentalny do ekranu i optymalizacji warunków analitycznych.
Rys. 1 Spectinomycyna hydrochlorek
2Instrument i metoda
W tym badaniu przeprowadzono analizę chromatograficzną przy użyciu systemu HPLC serii LC3200 Wayeal.komórkę kolumnySystem sterowania i pozyskiwania/przetwarzania danych wykonywano za pomocą oprogramowania chromatograficznego SmartLab 2.0.
Tabela 1 Warunki HPLC
| Kolumna chromatograficzna | Nova Atom PC18 (4.6*250mm, 5μm) |
| Faza ruchoma | 0.1mol/l roztworu wodnego kwasu trifluorooctowego |
| Prędkość przepływu (mL/min) | 0.6 |
| Temperatura kolumny | 35 |
| objętość wstrzyknięcia (μL) | 20 |
| Temperatura nebulizatora ELSD (°C) | 85 |
| Temperatura parownika ELSD (°C) | 80 |
| ELSD Temperatura wykrywania (°C) | 50 |
| Przepływ gazu (SLM) | 0.2 |
3Przygotowanie roztworu
Roztwór próbkowy:Roztwór podstawowy chlorku wodorowego spektinomycyny został dostarczony przez klienta w oznaczonym stężeniu 10 mg/ ml i o czystości 99, 8%.
0.1M roztwór wodny kwasu trifluorooctowego:Dokładnie pipetować 6,8 ml kwasu trójfluorooctowego do kolby objętościowej o pojemności 1000 ml. Rozcieńczyć do oznaczenia oczyszczoną wodą i dobrze zmieszać. Wreszcie, pod próżnią filtrować roztwór przez 0 °C.Filtr membranowy celulozowy o długości 45 μm przed użyciem.
Standardowe rozwiązania:Roztwór podstawowy rozcieńczono oczyszczoną wodą w celu przygotowania roztworów próbkowych o stężeniu 0.15, 0.25, 0.35, 0.50Każdy roztwór przed użyciem był następnie filtrowany przez filtr membranowy z celulozy o średnicy 0,45 μm.
4Wyniki i dyskusja
W chińskiej farmakopei stosuje się identyczne warunki chromatograficzne do analizy substancji pokrewnych i zawartości głównych składników w pozycji spectinomycyna hydrochlorku.Metoda stwierdza, że "detektor może być skonfigurowany w oparciu o rzeczywiste okolicznościW trakcie badania, biorąc pod uwagę właściwości instrumentalnych ELSD3260 oraz wymagania metody analitycznej oraz odpowiednią literaturę,W celu wykrycia wielu parametrów eksperymentalnych zastosowano projekt eksperymentalny Placketta-Burmana (tabele 2 i 3)Następnie zastosowano konstrukcję Box-Behnken (tabela 4) w celu optymalizacji reakcji na szczytowy obszar detektora ELSD.
Tabela 2 Projekt eksperymentalny Placketta-Burmana
| Nie, nie, nie. | Przepływ ((mL/min) | Temperatura kolumny ((°C) | Temperatura nebulizatora (°C) | Temperatura parownika (°C) | Temperatura wykrywania (°C) | Przepływ gazu (SLM) | Wynagrodzenie po kolumnie |
| 1 | 0.8 | 35 | 60 | 50 | 50 | 0.4 | - Nie, nie. |
| 2 | 0.6 | 35 | 50 | 60 | 50 | 0.6 | - Nie, nie. |
| 3 | 0.6 | 30 | 60 | 60 | 50 | 0.4 | - Tak, proszę. |
| 4 | 0.8 | 30 | 60 | 60 | 40 | 0.6 | - Nie, nie. |
| 5 | 0.6 | 35 | 60 | 50 | 40 | 0.6 | - Tak, proszę. |
| 6 | 0.8 | 30 | 50 | 50 | 50 | 0.6 | - Tak, proszę. |
| 7 | 0.8 | 35 | 50 | 60 | 40 | 0.4 | - Tak, proszę. |
| 8 | 0.6 | 30 | 50 | 50 | 40 | 0.4 | - Nie, nie. |
Tabela 3 Analiza ANOVA wyników eksperymentalnych Plackett-Burman
| Źródło różnic | Współczynnik | wartość t | wartość p | Znaczenie |
| Wpływ | - Sześć.687 | - Osiem.10 | < 0.01 | 2 |
| Temperatura kolumny | 0.191 | 0.22 | 0.824 | 6 |
| Temperatura nebulizatora (°C) | 5.342 | 6.29 | < 0.01 | 3 |
| Temperatura parownika (°C) | 4.135 | 4.87 | < 0.01 | 4 |
| Temperatura wykrywania (°C) | 0.171 | 0.21 | 0.842 | 7 |
| Przepływ gazu (SLM) | - Dziesięć.381 | - Dwanaście.23 | < 0.01 | 1 |
| Wynagrodzenie po kolumnie | - Dwa.559 | - Trzy.02 | < 0.01 | 5 |
Jak widać z tabeli 3, przepływ gazu, przepływ fazy ruchomej i kompensacja po kolumnie wykazywały negatywne skutki.wraz z wyłączeniem rekompensaty po kolumnieZmniejszenie prędkości przepływu fazy ruchomej może jednak prowadzić do zwiększenia rozszerzenia szczytu i zmniejszenia wrażliwości wykrywania.przepływ został utrzymany zgodnie ze standardową metodąO ile temperatura kolumny i temperatura wykrywania wykazywały pozytywne skutki, to nie zwiększyły one znacząco wartości odpowiedzi.Następne badania będą koncentrować się na optymalizacji przepływu gazu, temperatury nebulizatora i temperatury parownika.
Wpływ przepływu gazu, temperatury sprężarki,W celu określenia wartości odbioru, badania przeprowadzono przy użyciu projektu eksperymentalnego Box-Behnken w ramach metodyki powierzchni odbioru.Projekt eksperymentalny przedstawiony jest w tabeli 4.
Tabela 4 Projektowanie eksperymentalne Box-Behnken
| Nie, nie, nie. | Przepływ gazu (SLM) | Temperatura nebulizatora (°C) | Temperatura parownika (°C) |
| 1 | 0.15 | 75 | 80 |
| 2 | 0.15 | 85 | 80 |
| 3 | 0.25 | 75 | 80 |
| 4 | 0.25 | 85 | 80 |
| 5 | 0.15 | 80 | 75 |
| 6 | 0.15 | 80 | 85 |
| 7 | 0.25 | 80 | 75 |
| 8 | 0.25 | 80 | 85 |
| 9 | 0.2 | 75 | 75 |
| 10 | 0.2 | 75 | 85 |
| 11 | 0.2 | 85 | 75 |
| 12 | 0.2 | 85 | 85 |
| 13 | 0.2 | 80 | 80 |
The detection conditions for spectinomycin hydrochloride were determined by simulating the peak area variation using response surface methodology (Figure 2) and considering the instrumental parameter ranges: temperatura nebulizatora 85°C, temperatura parownika 80°C, temperatura detektora 50°C i przepływ gazu 0,2 SLM.
A. Wpływ natężenia przepływu gazu i temperatury parownika na obszar szczytu
B. Wpływ natężenia przepływu gazu i temperatury nebulizatora na obszar szczytowy
C. Wpływ temperatury sprężarki i temperatury parownika na obszar szczytowy
Rys. 2 Zmiany w obszarze szczytu
Dokładność wstrzyknięcia
Roztwór podstawowy chlorku wodorowego spektinomycyny został rozcieńczony do 0, 35 mg/ ml, a następnie wykonano sześć kolejnych wstrzyknięć w określonych warunkach chromatograficznych z rejestrowaniem chromatogramów.Wyliczono względne odchylenia standardowe (RSD%) czasu retencji i obszaru szczytowego dla szczytu chromatograficznegoWyniki przedstawiono w tabeli 5.
Tabela 5 Wyniki badań dokładności wtrysku
| Nie, nie, nie. | Czas przechowywania (min) | Wiek szczytowy (SU*) |
| 1 | 7.625 | 259.124 |
| 2 | 7.615 | 245.223 |
| 3 | 7.618 | 270.250 |
| 4 | 7.608 | 237.267 |
| 5 | 7.627 | 254.977 |
| 6 | 7.613 | 255.548 |
| RSD (%) | 0.09 | 4.49 |
Specyfikacja
Zgodnie z wytycznymi ICH Q2 ((R2) dotyczącymi walidacji procedury analitycznej oraz z ogólnym rozdziałem chińskiej farmakopei ¥9101 ¥ Wytyczne dotyczące walidacji metod analitycznych,optymalizowana metoda została zwalidowana pod względem specyficzności, zakres liniowy, dokładność i powtarzalność.
Woda oczyszczona i roztwór próbki (0,35 mg/ml) analizowano równolegle z nagrywanymi chromatogramami.Wyniki (rysunek 3) nie wykazały chromatograficznego szczytu w czasie retencji kloroklorku spektinomycyny w chromatogramie oczyszczonej wody., podczas gdy szczyt spectinomycyny w roztworze próbkowym osiągnął oddzielenie linii wyjściowej od sąsiednich szczytów (R > 1, 5).
Rys. 3 Wyniki analityczne próbki z hydrochlorkiem spektomycyny (0, 35 mg/ ml)
Zakres liniowy
Przygotować trzy równoległe próbki roztworu podstawowego chlorku wodorowodorowego spektinomycyny zgodnie ze standardową metodą przygotowania roztworu, przeanalizować je w warunkach chromatograficznych,i zapisać chromatogramyPrzeprowadzenie analizy regresji przy użyciu chromatograficznych obszarów szczytowych i odpowiednich stężeń.
Rys. 4 Wyniki badań liniowości (Log-transformed vs. Untransformed)
Zgodnie z literaturą związek między wartością odpowiedzi ELSD a stężeniem jest nieliniowy,wymagania przekształcenia logarytmicznego zarówno wartości odpowiedzi, jak i stężenia przed wykonaniem analizy regresji [8].,9Po zastosowaniu transformacji logarytmicznej do danych eksperymentalnych współczynnik korelacji krzywej regresji liniowej przekroczył 0.999, co jest znacznie lepsze niż wynik uzyskany bez przekształcenia logarytmicznego (jak pokazano na rysunku 4).
Dokładność i powtarzalność
Roztwór podstawowy chlorku wodorowodorowego spektinomycyny został rozcieńczony do stężenia 0.25, 0.35Dla każdego stężenia przygotowywano trzy równoległe próbki, analizowano je w określonych warunkach chromatograficznych i rejestrowano chromatogramy.Zawartość została obliczona przy użyciu krzywej regresjiWyniki przedstawiono w tabeli 6.
Tabela 6 Wyniki badań odzysku
| Nie, nie, nie. | Wartość rzeczywista (mg/ml) | Wartość obliczona (mg/ml) | Wynagrodzenie (%) | Wynagrodzenie RSD (%) |
| 1 | 0.25 | 0.252 | 100.8 |
1.36 |
| 2 | 0.25 | 0.251 | 100.4 | |
| 3 | 0.25 | 0.246 | 98.4 | |
| 4 | 0.35 | 0.348 | 99.4 | |
| 5 | 0.35 | 0.352 | 100.6 | |
| 6 | 0.35 | 0.344 | 98.3 | |
| 7 | 0.50 | 0.505 | 101.0 | |
| 8 | 0.50 | 0.513 | 102.6 | |
| 9 | 0.50 | 0.504 | 100.8 |
Ograniczenie ilościowe (LOQ)
Rozcieńcz roztwór podstawowy chlorku wodorowodorowego streptomycyny do stężenia 12 μg/ml. Analiza próbki w warunkach chromatograficznych i zapis chromatogramu.Obliczyć stosunek sygnału do hałasu (S/N) szczytu chromatograficznego chlorku wodorowodorowego streptomycyny i określić jego powtarzalnośćWyniki przedstawiono w tabeli 7.
Tabela 7 Wynik badania LOQ
| Nie, nie, nie. | SNR | Obszar szczytowy (SU*s) | Wskaźnik RSD (%) |
| 1 | 15.647 | 3.416 |
8.45 |
| 2 | 10.634 | 2.928 | |
| 3 | 15.728 | 3.145 | |
| 4 | 12.842 | 3.529 | |
| 5 | 14.662 | 3.396 | |
| 6 | 11.076 | 3.730 |
Wyniki wskazują, że zgodnie z wymogiem wytycznych ICH S/N > 10,w odniesieniu do tego stężenia roztworu hydrochlorku spektinomycyny względne odchylenie standardowe powierzchni szczytu spełnia kryteriaW związku z tym może służyć jako limit ilościowy dla spectinomycyny hydrochlorku.
5Wniosek
Na podstawie metody farmakopei, w tym badaniu ustalono wiarygodną i solidną procedurę analityczną do ilościowego określania zawartości chlorku wodorowego spektinomycyny.Warunki detektora rozpraszania światła (ELSD) zostały systematycznie zoptymalizowaneZoptymalizowana metoda wykazała zwiększoną stabilność i dokładność, wyższą czułość wykrywania oraz zadowalający zakres liniowy.
Detektor ELSD3260 jest nowo zaprojektowanym i opracowanym detektorem o niskiej temperaturze i rozdzielonym przepływie, który nadaje się do analizy zarówno substancji nieporywnych, jak i półporywnych,stanowiąc wartościową alternatywę dla związków nieabsorbujących promieniowania UVW tym badaniu stosowanie ELSD3260 do analizy chlorku wodorowego spektinomycyny zaowocowało doskonałymi wartościami odpowiedzi i możliwością odtwarzania, a także zwiększoną wrażliwością wykrywania.Wyniki te pokazują, że instrument ten jest odpowiedni do ilościowej analizy chlorku wodorowego spektinomycyny..
Wyślij do nas zapytanie
