Analiza kofeiny HPLC w napojach: Metoda Wanyi LC3500 DAD zwalidowana zgodnie z GB 5009.139-2014

Kofeina jest naturalnie występującym alkaloidem metyloksantynowym występującym w ziarnach kawy, liściach herbaty i kakao, i jest jednym z najszerzej stosowanych dodatków funkcjonalnych i charakterystycznych związków smakowych w napojach gazowanych, napojach energetycznych, napojach herbacianych i gotowych do spożycia kawach. Umiarkowane spożycie wyostrza czujność i łagodzi zmęczenie, jednak nadmierne lub długotrwałe spożycie może wywołać kołatanie serca, bezsenność i nerwowe pobudzenie, a grupy wrażliwe, takie jak kobiety w ciąży, dzieci i osoby z chorobami sercowo-naczyniowymi, tolerują znacznie niższe dawki. Krajowe normy bezpieczeństwa żywności określają zatem wyraźne limity kofeiny dla napojów.

W Chinach GB 5009.139-2014, Krajowa Norma Bezpieczeństwa Żywności dotycząca oznaczania kofeiny w napojach, stanowi podstawę prawną do kwantyfikacji kofeiny w matrycach napojów. Chromatografia cieczowa wysokosprawna (HPLC) stała się preferowaną techniką dla złożonych matryc, takich jak napoje kompozytowe, napoje mleczne i napoje funkcjonalne ziołowe, dzięki doskonałej separacji, silnej odporności na zakłócenia matrycowe i bardzo dokładnej kwantyfikacji.

Producent napojów potrzebował zweryfikować poziomy kofeiny w dwóch bardzo różnych liniach produktowych: napoju gazowanym typu cola i produkcie z herbaty mlecznej. Dwie matryce wymagają różnych strategii przygotowania: próbki gazowane muszą być odgazowane i oczyszczone, podczas gdy produkty zawierające mleko wymagają wytrącenia białek przed wstrzyknięciem. Oba musiały mieścić się w zakresie kalibracji, a system chromatograficzny musiał pozostać wolny od osadów matrycowych podczas długich sekwencji wstrzyknięć.

Odczynniki obejmowały wzorzec referencyjny kofeiny, metanol klasy HPLC, tlenek magnezu, roztwór kwasu trójchlorooctowego i wodę ultrapure.

• Roztwór macierzysty (2,0 mg/ml): 20 mg wzorca kofeiny, zważone z dokładnością do 0,1 mg, rozpuszczone w metanolu i uzupełnione do 10 ml; przechowywane w temperaturze 4 stopni C z okresem przydatności do spożycia wynoszącym sześć miesięcy.
• Roztwór pośredni (200 ug/ml): 5,0 ml roztworu macierzystego rozcieńczonego do 50 ml wodą; przechowywane w temperaturze 4 stopni C z okresem przydatności do spożycia wynoszącym jeden miesiąc.
• Robocze roztwory kalibracyjne: 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 i 10,0 ml roztworu pośredniego rozcieńczonego do 10 ml, dając 10,0, 20,0, 40,0, 100 i 200 ug/ml; przygotowywane świeżo w dniu analizy.

Napój typu cola: odgazować próbkę w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze 40 stopni C przez 5 minut. Ważyć 5 g (z dokładnością do 0,001 g), rozcieńczyć do 5 ml wodą tak, aby stężenie kofeiny mieściło się w zakresie kalibracji, dobrze wymieszać, dodać 0,5 g tlenku magnezu, ponownie wymieszać i pozostawić do osadzenia. Przefiltrować supernatant przez membranę 0,45 um przed wstrzyknięciem.

Napój kawowy i herbaciany z mlekiem: zważyć 1 g (z dokładnością do 0,001 g), rozcieńczyć do 10 ml roztworem kwasu trójchlorooctowego, dobrze wymieszać i pozostawić do wytrącenia białek, a następnie przefiltrować supernatant przez membranę 0,45 um.

Kształty pików były symetryczne, a liczba teoretycznych półek wysoka. Wstrzyknięcia czystego rozpuszczalnika nie wykazały zakłóceń w czasie retencji kofeiny, co potwierdza, że oczyszczanie tlenkiem magnezu i wytrącanie białek kwasem trójchlorooctowym skutecznie usuwa składniki matrycowe. Sześć kolejnych wstrzyknięć wykazało stabilny czas retencji i pole piku, co świadczy o doskonałej precyzji aparatu, podczas gdy odzysk powyżej 94% w obu matrycach dowodzi minimalnych strat próbki i solidnej procedury przygotowania.

Zgodnie z GB 5009.139-2014, system HPLC Wanyi LC3500 z detekcją z matrycą diodową zapewnił w pełni zwalidowany przepływ pracy do oznaczania kofeiny w napojach. Liniowość w zakresie 10,0 do 200,0 ug/ml z r > 0,9999, powtarzalność poniżej 0,3% RSD i odzysk powyżej 94% potwierdzają, że metoda jest dokładna, precyzyjna i powtarzalna zarówno dla produktów gazowanych, jak i zawierających mleko. Granice wykrywalności 0,0446 mg/kg i 0,75 mg/kg świadczą o niskim poziomie szumów i wysokiej czułości systemu, co czyni go odpowiednim do rutynowej kontroli jakości, weryfikacji etykiet i testów zgodności z przepisami w produkcji napojów oraz w laboratoriach zewnętrznych.

• Detekcja z matrycą diodową przy 272 nm zapewnia selektywną, niskoszumową kwantyfikację kofeiny w matrycach barwnych i mętnych.
• Prosta faza ruchoma metanol i woda na kolumnie C18 zapewnia szybkie i tanie przenoszenie metody między laboratoriami.
• Specyficzne dla matrycy oczyszczanie, tlenek magnezu dla napojów gazowanych i kwas trójchlorooctowy dla napojów na bazie mleka, chroni kolumnę i przedłuża jej żywotność.
• Stabilne czasy retencji i symetryczne piki zmniejszają potrzebę ponownego wstrzykiwania i powtarzania pracy w laboratoriach kontroli jakości o wysokiej przepustowości.