Pozostałości nitroimidazolu w wieprzowinie: metoda Wanyi LCMS-TQ9200 LC-MS/MS zatwierdzona zgodnie z GB 31658.23-2022
2026-10-21
Nitroimidazole to syntetyczne leki przeciwbakteryjne i przeciwpierwotniakowe, które skutecznie hamują bakterie beztlenowe i rzęsistki. Były one niegdyś szeroko stosowane w hodowli zwierząt i akwakulturze do zwalczania infekcji trawiennych i chorób pierwotniakowych, poprawiając wskaźniki przeżywalności. Jednakże leki macierzyste i ich metabolity są wykazują toksyczność: są szybko metabolizowane u zwierząt do kilku aktywnych metabolitów, z których niektóre pozostają w tkankach znacznie dłużej niż związek macierzysty.
Badania toksykologiczne pokazują, że związki macierzyste nitroimidazolu i ich główne metabolity są potencjalnie rakotwórcze, mutagenne i genotoksyczne. Pozostałości w żywności pochodzenia zwierzęcego dostają się do organizmu człowieka przez łańcuch pokarmowy, a długotrwałe spożycie w niskich dawkach może zakłócać hematopoezę, uszkadzać chromosomy i zwiększać ryzyko mutacji genów. Chiny zakazały zatem stosowania nitroimidazoli u zwierząt produkcyjnych, a pozostałości w żywności pochodzenia zwierzęcego są niedozwolone, co czyni precyzyjne badanie pozostałości niezbędnym dla bezpieczeństwa żywności.
GB 31658.23-2022, krajowa norma bezpieczeństwa żywności dotycząca pozostałości nitroimidazoli w żywności pochodzenia zwierzęcego metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas, stanowi podstawę prawną niniejszej pracy. Obejmuje ona związki macierzyste i metabolity w matrycach wołowych, owczych i innych zwierzęcych. Laboratorium badawcze potrzebowało zweryfikowanego przepływu pracy dla wieprzowiny obejmującego cztery docelowe związki - metronidazol, hydroksymetronidazol, dimetridazol i hydroksydimetridazol - w tym metabolity hydroksylowe, które trudniej zatrzymać i zjonizować, na poziomie poniżej ppb, z niskim przenoszeniem i stabilną precyzją w długich sekwencjach wstrzyknięć.
| Pozycja | Konfiguracja |
|---|---|
| System LC-MS/MS | Potrójny kwadrupol Wanyi LCMS-TQ9200 |
| Kolumna analityczna | C18, 1,6 um, 2,1 x 100 mm |
| Faza mobilna A | 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie |
| Faza mobilna B | 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu |
| Szybkość przepływu | 0,3 mL/min |
| Temperatura kolumny | 40 stopni C |
| Objętość wstrzyknięcia | 4 uL |
| Sprzęt pomocniczy | Łaźnia ultradźwiękowa, mieszadło vortex, wirówka wysokoobrotowa, łaźnia wodna, wyparka azotowa, waga analityczna |
Odważyć 2 g próbki (z dokładnością do 0,05 g) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodać 10 uL roboczego roztworu wewnętrznego standardu o stężeniu 1 ug/ml, mieszać przez 30 s i odstawić na 10 min. Dodać 15 ml octanu etylu, mieszać przez 2 min i wirować przy 10 000 obr/min przez 5 min. Przenieść supernatant i powtórzyć ekstrakcję raz z dodatkowymi 15 ml octanu etylu. Połączyć oba ekstrakty i odparować do sucha pod azotem w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni C.
Rozpuścić pozostałość w 5 ml 0,1 mol/l kwasu solnego, mieszać przez 1 min, dodać 5 ml n-heksanu, wstrząsnąć przez 1 min i wirować przy 5 000 obr/min przez 5 min. Odrzucić warstwę heksanową i powtórzyć odtłuszczanie raz z kolejnymi 5 ml heksanu. Kondycjonować kartridż do ekstrakcji fazy stałej 3 ml 0,1 mol/l kwasu solnego i 3 ml metanolu, załadować warstwę wodną, przemyć 3 ml 0,1 mol/l kwasu solnego i eluować 4 ml metanolu. Odparować eluat do sucha w temperaturze 35 stopni C pod azotem, odtworzyć w 0,5 ml wody, mieszać przez 1 min i przefiltrować przed wstrzyknięciem.
| Parametr | Wynik |
|---|---|
| Czas analizy | Cztery anality plus standardy wewnętrzne rozdzielone w ciągu 8 minut, symetryczne piki, silna odpowiedź |
| Liniowość | Kalibracja dopasowana do matrycy przy 2, 4, 20, 40, 200 i 400 ug/l; R2 powyżej 0,9995 dla wszystkich czterech związków, odchylenie poniżej 20% limitu |
| LOD i LOQ | Stosunek sygnału do szumu powyżej 3 przy 0,5 ug/kg i powyżej 10 przy 1 ug/kg, spełniający wymagania 0,5 ug/kg LOD i 1 ug/kg LOQ |
| Precyzja (n = 6) | RSD poniżej 6% przy 2 ng/ml i poniżej 3% przy 20 ng/ml, w stosunku do limitu 10% |
| Przenoszenie | Wstrzyknięcie blank po najwyższym standardzie 400 ng/ml znacznie poniżej 20% powierzchni piku LOQ |
| Odzysk z kolby | 61,8% do 103,35% przy 2 ng/ml i 104,35% do 107,15% przy 20 ng/ml, w ramach wymogu 60% do 120% |
| Próbka wieprzowiny z rynku | Nie wykryto żadnego z czterech nitroimidazoli |
Kalibracja dopasowana do matrycy w ekstrakcie z wieprzowiny blank kompensuje tłumienie jonów przez matrycę mięsną i zapewnia wiarygodną kwantyfikację na poziomie śladowym. Kształty pików były dobre, bez ogonowania, co potwierdza, że ekstrakcja octanem etylu, odtłuszczanie heksanem i oczyszczanie SPE usuwają zakłócenia przy 1 ug/kg.
System LC-MS/MS Wanyi LCMS-TQ9200 dostarczył zweryfikowaną metodę dla czterech pozostałości nitroimidazoli w wieprzowinie zgodnie z GB 31658.23-2022. Symetryczne piki, R2 powyżej 0,9995, precyzja w granicach 10%, znikome przenoszenie i odzysk w zakresie od 60% do 120% pokazują, że przepływ pracy spełnia rutynowe wymagania jakościowe i ilościowe dotyczące wykrywania i potwierdzania zakazanych leków weterynaryjnych oraz stanowi wiarygodną podstawę techniczną do monitorowania ryzyka bezpieczeństwa żywności.
- Akwirowanie w trybie potrójnego kwadrupola MRM zapewnia selektywność potrzebną do potwierdzenia zakazanych pozostałości na poziomie 0,5 ug/kg w tłustej matrycy mięsnej.
- Chemia C18 poniżej 2 um na kolumnie 2,1 mm przy 0,3 ml/min rozdziela cztery anality w ciągu 8 minut, przy niskim zużyciu rozpuszczalnika.
- Standardy wewnętrzne znakowane izotopowo korygują straty odzysku podczas ekstrakcji i SPE, stabilizując wyniki w partiach.
- Odtłuszczanie heksanem przed SPE chroni kartridż i kolumnę analityczną, przedłużając żywotność w laboratoriach o wysokiej przepustowości analizy pozostałości.
